激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的注意事項

2010年11月24日 09:53:57人氣：959來源：上海銳谷生物科技有限公司

《一》制備高特異性和價的熒光抗體

標(biāo)本只有在用熒光探針標(biāo)記的前提下才能進(jìn)行共聚焦顯微鏡檢測．制備高特異性和價的熒光抗體是檢測的關(guān)鍵。這就要求選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性與價的免疫血清。同時還要對熒光抗體進(jìn)行質(zhì)量鑒定，主要是進(jìn)行特異性和敏感性鑒定。

《二》標(biāo)本制作要求

1．標(biāo)本厚度組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，否則激發(fā)光多數(shù)消耗在標(biāo)本下部，而物鏡觀察的上部不能被充分激發(fā)。

2．載玻片載玻片要光潔，無自發(fā)熒光；載玻片厚度應(yīng)在0．8～1．2mm之間，太厚會吸收較多的光，不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚焦。

3．封固劑甘油必須無色透明，無自發(fā)熒光。由于熒光在pH 8．5～9．5時較亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液封片。

《三》定量研究的要求

1．隨機(jī)性

（1）在感興趣區(qū)域內(nèi)隨機(jī)抽樣，不能主觀地選擇一些便于定量的“理想切片”，這種“理想切片”不能代表所要研究的整體區(qū)域。

（2）在隨機(jī)抽取的切片上，應(yīng)隨機(jī)抽取觀察視野。

（3）在隨機(jī)抽取的視野中，通過連續(xù)觀察“光學(xué)切片”，得到感興趣結(jié)構(gòu)的三維定量信息。如果不能連續(xù)觀察“光學(xué)切片”，需要在Z軸方向隨機(jī)抽樣，然后作定量研究。

2．避免參照陷阱如果獲得的資料是密度信息，當(dāng)比較各組參照空間（包含待測結(jié)構(gòu)的區(qū)域）的體積不同時，根據(jù)密度信息可能得出錯誤結(jié)論。因此，需要注意所謂的參照空間“陷阱”問題。

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