培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇

2010年09月04日 15:41:36人氣：1232來源：上海瑞齊生物科技有限公司

細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。

1．凍存細(xì)胞

（1）選對數(shù)增生期細(xì)胞（證明無支原體污染），在凍存前1d換液。

（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×10⁷／ml左右密度，離心，去上清。

（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜（DMSO）或甘油，可使冰點降低，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。

（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。

（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)記。

（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。

操作時應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷。

2. 復(fù)蘇細(xì)胞

（1）從罐中取出凍存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。

（4）低速離心（500～1000r／min） 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。

（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。

凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達(dá)到10⁷／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×10⁵／ml數(shù)量。

關(guān)鍵詞：通用技術(shù)

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