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當前位置：上海士鋒生物科技有限公司>>公司動態>>家兔椎間盤細胞的體外培養方法
1、培養皿、培養瓶、燒瓶、試管等。
2、分離組織需要的眼科剪子、子。
3、5%CO2孵箱、PH計、95%氧氣源。
4、36電動恒溫水浴。
5、培養液、各種緩沖液及添加劑DMEM高糖培養基、Hank’s緩沖液 、20%胎牛血清，轉換生長因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰島素-轉鐵蛋白-硒（10ug/mL胰島素，5ug/mL轉鐵蛋白，和0.5ng/mL亞硒酸鹽）100U/Ml，100U/ml 。
6、消化液 膠原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%臺盼蘭、0.25
Method 1 組織塊法
1、取材：空氣栓塞法處死家兔后，在無菌狀態下獲取家兔椎間盤組織。置于準備好的DMEM培養基（含雙抗）。迅速帶回到無菌超凈臺上。（注意事項：椎間盤位于相鄰兩個椎體之間，取材過程較為繁瑣，要求動作迅速，爭取在家兔死后半小時內完成，否則，該組織對缺氧耐受性差導致培養失敗）。
2、剪切：在超凈臺上，進一步將周圍組織分離，用Hank’s液沖洗數遍，直到沖洗液透明為止。眼科剪刀將組織修剪為1~2cm3大小的小組織塊，Hank’s沖洗干凈。 加入少量含血清的培養液。(組織塊不宜過小，否則不容易爬出足夠數量的細胞)
3、接種：用吸管吸取小組織塊入培養瓶底部，擺放均勻，一個25cm2的培養瓶可放置10-15個小組織塊，翻轉培養瓶，加入少量培養液。4~6小時后，待組織塊充分貼壁后，再翻轉回來（動作一定要輕巧，以免剛剛貼壁的組織塊脫離瓶底）
4、置于5%CO2孵箱中培養，每隔3天換液。待細胞95%融合時，0.25傳代分瓶。
Method 2 消化法
前面步驟同組織塊法1，2。
（3）組織塊再進一步剪切，此時培養液中不加血清。完畢后，加入消化液，移入到10ml 離心管，培養箱內消化。每隔20分鐘，用吸管吹打一次，觀察液體有否變渾濁，并取少量液體，在相差倒置顯微鏡下觀察。0.4%臺盼蘭染色計算活細胞數目。接種密度在105數量級。置于5%CO2孵箱中培養，每隔3天換液。待細胞95%融合時，0.25傳代分瓶
Result: IVD細胞為類軟骨細胞，描述：單層細胞形狀不規則，可呈三角形、多角形，梭形及不規則形。不同于成纖維細胞
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