巨噬細胞培養

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以生存。

巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。

培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法zui為實用，其法如下：

1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內！），以刺流產生大量的巨噬細胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養基。

9、計數細胞。每只鼠可產生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。

10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數小時后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。

上皮細胞培養

1、取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊，早產流產兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

3、換入0.25%中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用或鑷子將表皮與層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%中，37℃，30—60分鐘。

6、反復吹打，制成懸液。

7、培養：用80目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2溫箱培養。體細胞培養

1、瓊脂鋪底的培養瓶：30ml無菌培養瓶，每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養基，冷卻，形成平坦底層后備用。

2、取生長狀態良好已連接成片的細胞，用彎頭吸管伸入瓶內，把細胞縱橫割劃成若干小區后，倒出培養液。

3、加入0.25%的液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當細胞小區邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養液3~5 ml，用吸管把已松動的細胞片吸打下來，分裝入1~3個含2%瓊脂培養基底層的培養瓶中，置溫箱繼續培養，數日后便可生長成細胞球體。

4、換液：培養1~2日后，如需換液，微傾斜培養瓶，令培養液集于培養瓶底角，停片刻，待球體細胞下沉后，吸除部分培養液，再補充新培養液。

羊水細胞培養

羊水中含有胎兒脫落的上皮細胞，可在體外培養用以分析胎兒染色體核型。目前國內外大都采用腹腔羊膜穿刺術，妊娠12-30周的羊水細胞均可培養成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析，*孕周為16周左右。因此時羊水增長快，羊水中細胞較多，細胞培養易于生長，而且不易損傷胎兒。國內多數選擇的穿刺時間在妊娠的第16-30周。國外現已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠時間大致計算（1ml/w）。資料表明，穿刺病例的妊娠結局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無明顯差異。

1、實驗材料

2,5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養瓶、培養液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養皿、蓋玻片等。

2、培養液配制

F-12 85%

小牛血清 15%

雙抗 100u/ml

小瓶貯藏 4-8℃

3、操作過程

A（蓋玻片培養法）

（1）采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中；（2）收集：離心分離細胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻；（3）接種：30mm培養皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細胞液1-2滴，置培養箱內培養30-60分鐘；（4）培養：取出后從蓋玻片外加培養液2ml，靜置培養48小時后觀察細胞生殖狀況并定時換液，5-10天后，可見大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長；（5）終止培養：當有大量圓形發亮細胞出現時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時；（6）低滲：倒掉培養液，加預溫37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見脹大的羊水細胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預固定；（7）固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復3次；（8）干燥：將附有細胞的蓋玻片斜放于培養皿中，置80℃烤箱處理2-3小時；（9）膠片：將附有細胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細胞破壞；

B（常規培養法）

（1）—（2）相同于蓋玻片培養法；（3）接種：將混勻的羊水細胞種置于50ml或100ml細胞培養瓶內，平均10ml羊水細胞收集的細胞種置一瓶加5-10ml混合培養液。（4）培養：酒精燈火先封口，靜置培養48小時后觀察細胞貼臂及生長情況，5-10天后可見瓶底面有大量羊水細胞生長；（5）終止培養：同A法；（6）細胞收集：將培養液倒入一干凈離心管中，加0.025%的0.5-1ml/瓶，輕輕搖動，使培養瓶底面*接觸消化酶，然后用彎頭吸管吹打，待細胞全部脫落后加前培養液終止消化。用吸管移細胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細胞沉慮。若一次消化不*，可反復消化；（7）低滲及預固定：加預溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預固定，用氣泡吹打細胞使其混勻。（8）固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入；（9）制片及干燥：用絨毛制片；（10）分帶處理。

血管內皮細胞培養

研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡便，其法如下：

1、產后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養，可于12小時內保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

3、用夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

原代軟骨細胞分離培養

1、一般根據實驗要求，選取不同年齡組的兔子，實際上兔子的年齡越小越好，畢竟幼體組織的活力要高于成體組織的活力，耳靜脈空氣注射法處死后,無菌條件下分離后肢關節軟骨和肋軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜，放入盛有PBS液的培養皿中。

2、將分離得到的軟骨組織剁碎成0.3-0.5mm的組織塊，移入25cm2培養瓶，用含雙抗的PBS液沖洗軟骨3次。

3、加入軟骨體積10-15倍的0.25%，37℃消化１－２小時后終止消化。

4、加入0.02%II型膠原酶，37℃消化17-20小時（也就是過夜），這是我們實驗室摸索出來的方法，雖然比較浪費時間，但是獲得的細胞活力確實不錯。

5、在倒置顯微鏡下觀察，當游離出單個細胞后，加入DMEM培養液將II型膠原酶稀釋終止消化。

6、將細胞團吹打成單個細胞后用200目濾網過濾，收集濾液，1500r/min離心5min。

7、棄上清，加入DS培養液重懸，0.2%臺盼藍染色，活細胞率大于90%，CO2培養箱孵育。