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反義技�(shù)——RNA干擾
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�(guān) � � | 反義技�(shù)——RNA干擾(RNA interference,RNAi�,反義技�(shù)——RNA干擾(RNA |
- 【資料簡介�
zui近由于RNA干擾(RNA interference,RNAi)的�(fā)�(xiàn)使反義領(lǐng)域的研究增多。這種自然�(fā)生的�(xiàn)象zui早是在秀麗線蟲中�(fā)�(xiàn)的(1),是序列特異性地使轉(zhuǎn)錄后的基因沉默的有力機制。由于zui近兩年在RNAi�(lǐng)域取得的進步,已�(jīng)有許多這方面的綜述�(fā)表(2-4)。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子�(fā)動的,該分子可以被Dicer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA(見圖)。RNaseIII蛋白被認為是作為一個二聚體�(fā)揮作用,它對雙鏈RNA的兩個鏈都進行切割,酶切的�(chǎn)�3’末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子(small interfering RNAs,siRNAs)摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC),引導(dǎo)核酸酶降解靶RNA�
這種保守的生化機制可用于研究多種模式生物的基因功能,但是它在哺乳動物細胞中的�(yīng)用受到阻礙,因為長的雙鏈RNA分子會引起干擾素�(yīng)答。因此Tuschi及其同事表明長度�21nt的siRNA可以特異性的抑制哺乳動物細胞基因表達是一個革命性的突破�5)。這個發(fā)�(xiàn)激�(fā)了大量利用rnai技�(shù)對哺乳動物細胞的研究,因為與傳統(tǒng)的反義技�(shù)比,RNAi的性能明顯較高� 反義技�(shù)——RNA干擾(RNA interference,RNAi�
有趣的是,除了短雙鏈RNA,短�(fā)夾RNA(small nuclear RNA,snRNA)比如莖�(huán)�(jié)�(gòu)在細胞內(nèi)�(jīng)過加工后也可以變成siRNA,從而產(chǎn)生RNA干擾�6�7)。這使得構(gòu)建表達干擾RNA的載體,從而使哺乳動物細胞�(nèi)基因表達沉默成為可能�4�8)。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動子轉(zhuǎn)錄,在正常情況下,該啟動子是控制小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)U6�6�7�9�10)或者RNaseP的組分H1 RNA�11)轉(zhuǎn)錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動子轉(zhuǎn)錄出來(6�12�13)。載體介�(dǎo)的siRNA表達使對功能缺失(loss-of-function)表型進行分析成為可能。在�(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞�(nèi),兩個月后仍可觀察到沉默�(xiàn)象(11)�另外一種延長sirna抑制基因表達時間的方法是對化�(xué)合成的RNA進行核苷酸修飾。盡管未�(jīng)修飾的短雙鏈RNA在細胞培�(yǎng)物或者體�(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高,然而有些情況下,需要對siRNA的穩(wěn)定性進行進一步提高。因此,可以在兩條鏈的末端都引入�(jīng)過修飾的核苷�14)。一�5’端為兩�2�-O-甲基RNA�3’端�4個甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未�(jīng)修飾的siRNA比活性相同,但是在細胞培�(yǎng)物中引起的基因沉默現(xiàn)象的時間延長。然而,增多siRNA中的甲基化核苷,或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將�(dǎo)致siRNA活性下降�
RNA干擾在哺乳動物體�(nèi)�*個研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shrna的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈�15�16)。在大多�(shù)器官中,報道基因(編碼于共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或者轉(zhuǎn)基因小鼠上)的表達可以被有效地抑制。另外,F(xiàn)as基因被作為肝損傷治療相關(guān)的內(nèi)源靶標進行了RNA干擾實驗�17)。注射siRNA之后,小鼠肝細胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆�(fā)性肝炎,82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期,而所有的對照小鼠�3天之�(nèi)死亡�
上述研究中采用的高壓�(dǎo)入技�(shù)是一種粗暴的方法,不適于治療用。因此,標準的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個反�(zhuǎn)錄病毒載體被用于�(dǎo)入siRNA,以抑制人類胰腺腫瘤細胞中的癌基因K-ras等位基因�18)。負�(diào)控癌細胞中K-ras基因的表達使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項研究還表明siRNA的高度特異性,因為只有癌基因K-ras被沉默,而與之只�1個堿基對差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外,�(dāng)在紋狀區(qū)注射表達siRNA的腺病毒之后,轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GFP基因的表達可以被抑制�19)。β-葡萄糖醛酸苷酶(b-glucoronidase)的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是,具有CMV啟動子和zui小的polyA尾的RNA聚合酶II表達元件被用于這個實驗,為設(shè)計組織特異性或者可誘導(dǎo)的siRNA載體打開了大門�總的來說,siRNA�*個體�(nèi)實驗已經(jīng)進行,其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何�(yīng)用siRNA引起的毒性作用,但是在治療人類疾病的臨床試驗開始之前仍需小心,以排除使用RNA干擾引起的嚴重副作用。因為用siRNA使基因表達沉默與傳統(tǒng)的反義技�(shù)相似,研究者將從十多年來反義技�(shù)研究的教�(xùn)中獲益,比如需要使用合適的對照以證明基因表達的敲除是特異性的,以及對免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進行詳細分析�
總結(jié)
�(jīng)過盛衰沉浮,反義技�(shù)近年來得到越來越多的注意。對能夠提高靶表親和性和生物�(wěn)定性、降低毒性的修飾核苷的研究取得了重要進展。由于大多數(shù)新的DNA類似物不能激活RNaseH,對反義寡核苷酸的設(shè)計需要考慮靶mRNA是否需要保留,例如,是改變剪接方式,還是降解靶mRNA(這種情況下應(yīng)該使用gapmer技�(shù))。可以通過有系�(tǒng)的修飾天然核酶或者通過體外選擇技�(shù)獲得具有高催化活性的�(wěn)定核酶。一些反義寡核苷酸和核酶已經(jīng)進入臨床試驗研究,一個反義藥物已�(jīng)�1998年獲得批準。一個重要的突破是發(fā)�(xiàn)短的雙鏈RNA分子可用于哺乳動物細胞中特異性沉默基因表達。這個方法與傳統(tǒng)的反義技�(shù)比效率明顯更高,并且一些體�(nèi)實驗的數(shù)�(jù)已經(jīng)�(fā)表。因此,反義技�(shù)有望廣泛�(yīng)用于對未知功能基因的研究、藥物靶標的確認和治療�
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