大鼠25-羥基*3��25（OH）D3）酶聯免疫分析（ELISA��

【資料簡介��

大鼠25-羥基*3��25（OH）D3）酶聯免疫分析（ELISA��

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使��       目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關液體樣本��25-羥基*3��25（OH）D3）的含量��

實驗原理��

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大��25-羥基*3��25（OH）D3）水平。用純化的大��25（OH）D3抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入25（OH）D3，再與HRP標記��25（OH）D3抗體結合，形成抗��-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中��25-羥基*3��25（OH）D3）呈正相關。用酶標儀��450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大��25-羥基*3��25（OH）D3）濃度��

試劑盒組成：

試劑盒組��	48孔配��	96孔配��	保存
說明��	1��	1��
封板��	2片（48��	2片（96��
密封��	1��	1��
酶標包被��	1×48	1×96	2-8℃保��
標準品：27μg/L	0.5ml×1��	0.5ml×1��	2-8℃保��
標準品稀釋液	1.5ml×1��	1.5ml×1��	2-8℃保��
酶標試劑	3 ml×1��	6 ml×1��	2-8℃保��
樣品稀釋液	3 ml×1��	6 ml×1��	2-8℃保��
顯色劑A��	3 ml×1��	6 ml×1��	2-8℃保��
顯色劑B��	3 ml×1��	6 ml×1��	2-8℃保��
終止��	3ml×1��	6ml×1��	2-8℃保��
濃縮洗滌��	��20ml×20倍）×1��	��20ml×30倍）×1��	2-8℃保��

 

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝��10-20分鐘，離��20分鐘左右��2000-3000��/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心��

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混��10-20分鐘后，離心20分鐘左右��2000-3000��/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心��

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右��2000-3000��/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行��

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離��20分鐘左右��2000-3000��/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100��/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離��20分鐘左右��2000-3000��/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心��

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離��20分鐘左右��2000-3000��/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用��

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放��-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性��

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品��10孔，��*、第二孔中分別加標準��100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后��*孔、第二孔中各��100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各��50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各��50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都��50μl，濃度分別為18μg/L ��12μg/L��6μg/L��3μg/L�� 1.5μg/L）��

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣��10μl（樣品zui終稀釋度��5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻��

3. 溫育：用封板膜封板后��37℃溫��30分鐘��

4. 配液：將30��48T��20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30��48T��20倍）倍稀釋后備用��

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜��30秒后棄去，如此重��5次，拍干��

6. 加酶：每孔加入酶標試��50μl，空白孔除外��

7. 溫育：操作同3��

8. 洗滌：操作同5��

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯��15分鐘. 

10. 終止：每孔加終止��50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）��

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）�� 測定應在加終止液��15分鐘以內進行��

注意事項��

1�� 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平��15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存��

2�� 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果��

3�� 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣��

4�� 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品��*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數��×n×5）��

5�� 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染��

6�� 底物請避光保存��

7�� 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為��.

8�� 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理��

9�� 本試劑不同批號組分不得混用��

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準��

計算��

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，    

在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD      

值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀��      

倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出��      

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD��      

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀��      

倍數，即為樣品的實際濃度��                  

  

                                              

 

（此圖僅供參考）

 

 

 

試劑盒性能��

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990以上��

2.批內與批見應分別小于9%��11%

 

檢測范圍��                                              

1μg/L– 20μg/L                                        

                            

保存條件及有效期��

1.試劑盒保存：��2-8℃��

2．有效期��6個月

 

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