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雅氏瓦螨PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

2023�01�13� 14:10:14人氣�101�(lái)源:上海一研生物科技有限公司

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【資料簡(jiǎn)介�

雅氏瓦螨PCR檢測(cè)試劑��(shuō)明書

�(chǎn)品特�:

 

靈敏度高:能�(duì)低拷貝或多樣性模板�(jìn)行定量�

特異性強(qiáng):采用熱啟動(dòng)酶的激活機(jī)制,抑制非特異性擴(kuò)� �

重復(fù)性好:擴(kuò)增曲線重合度高,受干擾影響少�

�(kuò)增效率高:擴(kuò)增曲線Ct值低,起峰快,效率高�

原理:

所謂實(shí)�(shí)熒光定量PCR技�(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基�(tuán),利用熒光信�(hào)積累�(shí)�(shí)�(jiān)�(cè)整�(gè)PCR�(jìn)程,后通過�(biāo)�(zhǔn)曲線�(duì)未知模板�(jìn)行定量分析的方法�

雅氏瓦螨PCR檢測(cè)試劑�需要自備的器材�

1.儀器:分析天平、離心機(jī)、熒� PCR �(kuò)增儀、組織研磨器�-20 ℃冰箱、可�(diào)移液器(2 µL�20µL�200 µL�1000 µL)�

2.耗材:熒� PCR 反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水�1.5 mL �(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)水

處理的滅菌離心管、吸頭(10 µL�200 µL�1000 µL)、滅菌雙蒸水�

具有下列特點(diǎn)�

1.�(chǎn)品僅用于科研即開即用,用戶只需要提供樣� DNA 模板,操作簡(jiǎn)單,定量�(zhǔn)確快速�

2. 引物�(jīng)過優(yōu)化,特異性強(qiáng)。預(yù)期的 PCR �(chǎn)物長(zhǎng)度為 560 bp�

3. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳�

4. 提供�(yáng)性對(duì)照,便于分析試驗(yàn)�(jié)果�

檢測(cè)方法�

1.Ⅰ法�

在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,�(fā)射熒光信�(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)�(fā)射任何熒光信�(hào),從而保證熒光信�(hào)的增加與PCR�(chǎn)物的增加wan全同步�

定量PCR�(kuò)增熒光曲線圖

PCR�(chǎn)物熔解曲線圖

2.TaqMan探針法:

探針完整�(shí),報(bào)告基�(tuán)�(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基�(tuán)吸收;PCR�(kuò)增時(shí),Taq酶的5�-3’外切酶活性將探針酶切降解,產(chǎn)品僅用于科研使報(bào)告熒光基�(tuán)和淬滅熒光基�(tuán)分離,從而熒光監(jiān)�(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一�(gè)熒光分子形成,實(shí)�(xiàn)了熒光信�(hào)的累積與PCR�(chǎn)物的形成wan全同步�

雅氏瓦螨PCR檢測(cè)試劑�熒光定量PCR�(shí)�(yàn)步驟�

①取凍存已裂解的�(xì)胞,室溫放置5分鐘使其wan全溶解�

②兩相分� �1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手�(dòng)劇烈振蕩管體15秒后�15�30℃孵�2�3分鐘�4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑�60%�

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈�(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15�30℃孵�10分鐘后,�4℃下12000rpm 離心10分鐘。此�(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和�(cè)壁上形成膠狀沉淀塊�

④RNA清洗 移去上清液,�1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml�75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后�4℃下7000rpm離心5分鐘�

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘�

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA�(shí),先加入�(wú)RNA酶的�40μl用槍反復(fù)吹打幾次,使其wan全溶解,獲得的RNA溶液保存�-80℃待用� 1)紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)�(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀�(1:100)后,讀取其在分光光度計(jì)260nm�280nm處的吸收值,�(cè)定RNA溶液 濃度和純度。反�(yīng)五要素:

斯氏分枝桿菌PCR檢測(cè)試劑盒費(fèi)用參加PCR反應(yīng)的物�(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特異性反�(yīng)的關(guān)鍵,PCR �(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列� 就能按其�(shè)�(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)�(jì)引物�(yīng)遵循以下原則�

①引物長(zhǎng)度: 15-30bp,常用為20bp左右�

②引物擴(kuò)增跨度: �200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)�10kb的片段�

③引物堿基:G+C含量�40-60%為宜,G+C太少�(kuò)增效果不佳,G+C過多易出�(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布,避�5�(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列�

④避免引物內(nèi)部出�(xiàn)二級(jí)�(jié)�(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,�(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶�

⑤引�3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二�(gè)堿基,應(yīng)�(yán)格要求配�(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗�

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)� 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位�(diǎn)� 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處�

⑦引物的特異性:引物�(yīng)與核酸序列數(shù)�(jù)�(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性�

引物量:每條引物的濃�0.1�1umol�10�100pmol,以低引物量�(chǎn)生所需要的�(jié)果為好,引物濃度偏高�(huì)引起�(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的�(jī)�(huì)�

 

雅氏瓦螨PCR檢測(cè)試劑� �(shí)�(yàn)注意事項(xiàng)�

 

1)RT-PCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料,不同的樣本有不同要求,�(shí)�(yàn)前請(qǐng)充分溝通確�(rèn)�(shí)�(yàn)方案和樣本情況;

 

2)客戶盡可能提供�(shí)�(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID�(hào)�

 

3)客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品�

 

4)樣本保存于液氮或干冰,也可以保存于Trizol液中�

 

�(shí)�(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基�(tuán),利用熒光信�(hào)積累�(shí)�(shí)�(jiān)�(cè)整�(gè)PCR�(jìn)程,*通過�(biāo)�(zhǔn)曲線�(duì)未知模板�(jìn)行定量分析的方法。實(shí)�(shí)熒光定量PCR的化�(xué)原理包括探針類和非探針類兩類,探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針�(lái)指示�(kuò)增產(chǎn)物的增加,非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)�(jì)的引物來(lái)指示�(kuò)增的增加。運(yùn)用該技�(shù)可以�(duì)DNA、RNA樣品�(jìn)行定量(包括*定量和相�(duì)定量)和定性分析�

 

主要服務(wù):DNA或RNA�*定量分析、基因表�(dá)差異分析、基因分型�

 

主要技�(shù):引物設(shè)�(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR�

 

 


上海一研生物科技有限公司作�

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