支原體菌株來源：M.Arginini ATCC23838 支原體,M.FermentaneATCC19989發酵支原體 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原體 ,M.HominisATCC23114人型支原體 ,M.OraleATCC23714口腔支原體 ,M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體。其共同引物序列來自16s和23s保守區域，外部引物為F1 5′-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3′，R1 5′-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′;內部引物為 F2 5′-GTTCTTTGAAAACTGAAT-3′，R2 5′-GCATCCACCAAAAACTCT-3′。

PCR反應體系和條件：10×緩沖液(10mMTris-HCl、500mMKCl、20mMMgCl2、0.01%明膠)、primerF1、R1、F2、R2的濃度為2nmol/μL、2.5mMd NTPs、Taq酶、H2O、石蠟油覆蓋。反應溫度和時間為:94℃/2min預變性、94℃/30s變性、55℃/1min退火、72℃/1min延伸,循環30次后72℃延伸5min。第1次PCR反應取模板10μL,第2次PCR反應以第1次PCR擴增產物為模板取1μL。

下面有更詳細的：

污染測試--支原體 : PCR方法

原理：

利用具特殊專一性之primers，經由pcr反應來復制mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma種類不同而不同，因此可依所復制之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑒定。

特點：靈敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)。可偵測不易培養之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培養mycoplasma作為正反應對照組，避免可能之污染。

缺點︰PCR反應很靈敏，易有偽陽性結果。此方法尚在評估中，故結果僅作為參考和內部品管之一部份。

材料與設備：

ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.

提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture

positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)

PCR reagents :

Taq polymerase ( 5 U / ul )

dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )

10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)

25mM MgCl2

sterile ddH2O

Machine / Equipment：

PCR thermal cycler

agarose電泳設備

DNA電泳膠體觀察設備

無菌PCR反應管

無菌1.5 ml微量離心管

無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

方法：

此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1st stage PCR結束后，取其反應物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。

結果：使用UV light觀察，并照相記錄。

不過應用較多還是巢式PCR

方法：

此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1st stage PCR結束后，取其反應物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。

結果：使用UV light觀察，并照相記錄。

方法再詳盡點:

3.1 1st stage PCR reaction(total volume 25 ul)：

3.1.1 測試樣品 ( 2 ul / each )

3.1.1.1 直接取樣測試細胞之培養液。

3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )

3.1.1.3 Negative control : ddH2O

3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )

3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul

3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l

3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul

3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul

3.1.3 PCR program ( 1st PCR與2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler

3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min

3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min

3.1.3.5 重復3.1.3.2至3.1.3.4步驟30 cycles

3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min

3.2 2 nd stage PCR reaction(total volume 25 ul)

3.2.1 測試樣品：1st stage PCR product(1 ul / each)。

3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )

3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul

3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul

3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul

3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul

3.2.3 PCR program同3.1.3;使用PCR thermal cycler

4.0 膠片電泳分析

4.1 膠片 (2.0%) 置備: 將2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。

4.2 電泳液：(1x) TAE buffer(Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer)

4.3 選擇100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )

4.4 取10 ul 2 nd stage PCR產物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。

4.5 進行電泳分離100V, 25 min。

4.6 膠片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。(EtBr為致癌物質，請戴手套并小心操作)

4.7 結果：使用UV light觀察，并照相記錄。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)

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