人內皮型一氧化氮合酶試劑盒實驗原理

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：
156 pg/mL -10000 pg/mL

實驗原理
本人內皮型一氧化氮合酶試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中eNOS水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入eNOS抗原、*化的抗人eNOS抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的eNOS呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成
1.酶聯板：一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，310 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內配制。
如配制5000 pg/mL標準品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
6.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
7.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液：1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標本的采集及保存
1．血清：人內皮型一氧化氮合酶標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應120分鐘。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4.每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。
6.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時蘭色立轉黃色）。用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1．每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
2．為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將*的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性
本人內皮型一氧化氮合酶試劑盒可同時檢測重組或天然的人eNOS，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項
1．洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2．一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，*使用排槍加樣。
3．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
4．如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。

說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
5．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。