液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動(dòng)力學(xué)理論等都可用于液相層析。
1. 液相層析儀典型的液相層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測(cè)系統(tǒng)三部分。流動(dòng)相用一高壓泵輸入。
這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：
（1）流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。
（2）能抗溶劑腐蝕。
（3）有較高的輸出壓力，一般要達(dá)到15~300 kg/c，也有的高達(dá)800 kg/c。
（4）泵的死體積要小。
梯度洗脫裝置必須具備兩臺(tái)高壓泵，一臺(tái)輸送強(qiáng)溶劑，一臺(tái)輸送弱溶劑，兩泵運(yùn)轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求改變流動(dòng)相的組成，以改善分離效果。
一般用微量注射器直接進(jìn)樣，也可采用六通閥門進(jìn)樣。HPLC中所用的檢測(cè)器zui多應(yīng)用的是紫外吸收檢測(cè)，靈敏度可達(dá)ng水平。此外，還有熒光檢測(cè)器、示差析光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。
2. HPLC的類型與應(yīng)用
（1）液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機(jī)酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動(dòng)相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調(diào)節(jié)試樣組份的滯留時(shí)間長(zhǎng)短，并對(duì)試樣中某幾個(gè)組份具有選擇性作用。
流動(dòng)相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環(huán)已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據(jù)試樣性質(zhì)選用針對(duì)性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分離異構(gòu)體、抗氧化劑與維生素等。
（2）液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團(tuán)結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學(xué)鍵合相層析。
另一種利用離子對(duì)原理的液-液分配層析為離子對(duì)層析。化學(xué)鍵合層析分：
①極性鍵合相層析：固定相為極性基團(tuán)，氰基、氨基及雙羥基三種。流動(dòng)相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。
②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團(tuán)，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動(dòng)相用強(qiáng)極性溶劑，如水、醇、乙腈或無(wú)機(jī)鹽緩沖液。
zui常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因吸附而至的拖尾現(xiàn)象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。
離子對(duì)分配層析分：
①正相離子對(duì)層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對(duì)離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。
流動(dòng)相為極性較低的有機(jī)溶劑。在層析過(guò)程中，待分離的離子與水相中配對(duì)離子形成中性離子對(duì)，在水相和有機(jī)相中進(jìn)行分配，而達(dá)到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是流動(dòng)相選擇余地大，缺點(diǎn)是固定相易流失。
②反向離子對(duì)層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對(duì)離子同時(shí)存在于強(qiáng)極性的流動(dòng)相中，生成的中性離子對(duì)在流動(dòng)相和鍵合相之間進(jìn)行分配，而得到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是固定相不存在流失問(wèn)題、流動(dòng)相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。
（3）離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動(dòng)相主要是水溶液，pH值在被分離酸、堿的pK值附近。
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